Modelación molecular y caracterización bioquímica parcial de la catepsina B del camarón blanco (Litopenaeus vannamei)

Abstract

La Catepsina B es una cisteíno proteasa lisosomal ampliamente estudiada en mamíferos debido a que se le ha relacionado con procesos de progresión de la metástasis tumoral. Se ha observado que tiene un papel clave en la infectividad y nutrición de parásitos helmintos, así como en el desarrollo embrionario y metamorfosis de algunos invertebrados. Recientemente, el transcrito de la catepsina B fue identificado en el camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) y además se ha reportado la expresión de esta enzima en diferentes tejidos de este organismo. También se ha sugerido que la enzima participa no sólo en procesos digestivos degradando la proteína del alimento, sino que también se le ha relacionado con la respuesta inmune del camarón frente a la infección con el virus de la mancha blanca (WSSV). Por lo anterior, el estudio de las características bioquímicas y fisicoquímicas de la catepsina B del camarón blanco permitirá entender de mejor manera el rol fisiológico de esta enzima en los crustáceos. El objetivo de este trabajo fue realizar la modelación in silico y la caracterización bioquímica parcial de la enzima catepsina B de L. vannamei. Lo anterior mediante la construcción de un modelo tridimensional predictivo in sílico, la identificación de la proteína en el extracto enzimático del camarón blanco, el aislamiento parcial y la realización de ensayos de actividad con sustrato fluorogénico específico para determinar sus parámetros óptimos. El modelo estructural predictivo sugiere que la catepsina B de L. vannamei posee las características típicas de una cisteíno proteasa lisosomal con actividad de endo y exopeptidasa. Los patrones proteicos de los extractos enzimáticos de la glándula digestiva de organismos adultos sanos mostraron una banda de un peso molecular aproximado a 26 kDa cuya actividad proteolítica fue afectada por el inhibidor específico de císteín proteasas E-64; sin embargo, no se observaron bandas de proteínas con el peso molecular esperado en los extractos proteicos de tejidos no digestivos del camarón. Se confirmó que el sustrato fluorogénico Z-Arg-Arg-AMC, reportado como específico para determinar la actividad de la catepsina B, no sólo es hidrolizado por esta, sino también por las 3 isoformas de tripsina presentes en la glándula digestiva del camarón blanco. Las fracciones obtenidas por cromatografía de afinidad, libres de tripsinas, cuentan con una sola proteína activa, la catepsina B, que representa sólo el 3.56% de la actividad total reportada para el extracto completo. El pH y la temperatura óptima para estas fracciones fue de 5.5 y 45°C, respectivamente.