Física-química en la síntesis de nanopartículas de plata con PEG y su efecto en la amplificación de la señal Raman de eritrocotos vivos

Abstract

La micro-espectroscopía Raman permite el estudio ¨no invasivo¨ de procesos biológicos que provocan cambios en la intensidad y/o posición de picos en el espectro Raman de una célula. La sensibilidad de la técnica mejora notablemente cuando se analizan moléculas muy cercanas a la superficie de nanopartículas (NPs) de plata (menos de 20 nm). Este fenómeno se conoce como SERS (siglas del inglés: Surface-Enhanced Raman Scattering). En este trabajo, evaluamos el efecto de NPs de plata, sintetizadas por dos métodos diferentes, en la amplificación de la señal Raman de eritrocitos vivos. El espectro Raman de la hemoglobina (Hb) está muy bien caracterizado, dado que esta es la proteína mayoritaria en la composición de los eritrocitos, estas células constituyen un modelo adecuado para el estudio del efecto de amplificación de la señal Raman por NPs de plata. Las moléculas de poli-etilenglicol (PEG) le confieren a las NPs metálicas biocompatibilidad y estabilidad, características necesarias para sus aplicaciones biológicas. Este polímero es muy empleado como agente reductor y estabilizante en la síntesis de NPs de plata (NPs AgPEG). En algunas ocasiones, el procedimiento utilizado se lleva a cabo en atmósfera oxidante y a elevadas temperaturas (mayores de 70ºC), sin considerar la susceptibilidad del PEG a la degradación térmica oxidativa. En la síntesis de NPs de plata con PEG en condiciones favorables a dicho proceso de degradación (O2 / 70ºC), los grupos de Luo (Luo et al., 2005) y Nam (Nam et al., 2011) observaron que la actividad reductora del PEG mejora al incrementar la temperatura o emplear un PEG de mayor peso molecular. Sin embargo, estas observaciones no pueden ser explicadas en base a los mecanismos de reducción de iones Ag+ encontrados en la literatura, los cuales solo involucran a los grupos terminales de las moléculas PEG en la reducción de iones plata. Por otro lado, encontramos que algunos procedimientos publicados para la síntesis de NPs AgPEG son difíciles de reproducir. Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, en este trabajo estudiamos la influencia de diferentes factores como: la temperatura, la presencia de oxígeno y la concentración del precursor de plata, en la síntesis de NPs AgPEG. Nuestros resultados aportan evidencia experimental que involucra a la degradación térmica oxidativa del PEG en un nuevo mecanismo que proponemos para explicar la potenciación de la reducción de iones Ag+ y estabilización de NPs AgPEG. Adicionalmente, el estudio anterior permitió establecer condiciones de síntesis reproducibles para la obtención de NPs AgPEG estables en el coloide por al menos dos años. Dicha estabilidad facilita la comparación entre estudios realizados en diferentes momentos y con diferentes células. De manera similar, la reproducibilidad de este método de síntesis y la estabilidad de las NPs que se obtienen, permitiría comparar los resultados obtenidos por distintos grupos de trabajo. Otra ventaja del uso del PEG como agente reductor y estabilizante en la síntesis de NPs AgPEG es que no resulta dañino al medio ambiente (método verde) a diferencia de otros agentes reductores empleados con el mismo fin. En nuestros experimentos, también sintetizamos NPAgs empleando NaBH4 como agente reductor y citrato de sodio como agente estabilizante. Este tipo de NPAgs son muy empleadas en estudios SERS y aunque no son estables a largo plazo, el método de síntesis es fácil de reproducir. De esta manera, obtuvimos NPs de plata por dos métodos diferentes (NPs AgPEG y NPAgs), obteniendo en ambos casos NPs de plata esféricas, cubiertas por distintos agentes estabilizantes y con tamaños promedios entre 20 y 25 nm aproximadamente. Las NPs AgPEG y NPAgs se evaluaron como amplificadores de la señal Raman de glóbulos rojos (GR) vivos, obteniendo incrementos entre 100-10 000 en diferentes picos del espectro Raman. La intensidad de la señal Raman de GR incubados con las NPAgs fue mayor que en aquellos incubados con las NPs AgPEG. En el espectro de GR control, están presentes algunos picos de oxi-Hb ausentes en el espectro de GR incubados con NPs de plata. Las moléculas de desoxi-Hb tienen mayor afinidad de unión a la membrana del GR, por lo cual están más cercanas a NPs que se unen a la membrana del eritrocito que las moléculas de oxi-Hb. Por esta razón, la ausencia de picos de oxi-Hb en los espectros Raman de GRs incubados con NPs de plata sugiere una ubicación extracelular de dichas NPs. En este punto de la exposición de nuestros resultados, discutimos aspectos relacionados con los mecanismos que contribuyen a la amplificación de la señal Raman de los GRs vivos, así como perspectivas para la aplicación de estas NPs.